Ricercatori INSTM realizzano sistema abiotico per rivelare le lisine mono-metilate dell’istone H3

Nelle cellule eucarioti il materiale genetico è ospitato all’interno di un compartimento specializzato, il nucleo cellulare dove il filamento di DNA è impacchettato in una struttura chiamata cromatina, un complesso nucleoproteico stabile comprendente DNA e proteine.

L’unità fondamentale della cromatina è il nucleosoma, un vero e proprio “rocchetto” molecolare, costituito da otto proteine disposte in coppia (gli istoni H2A, H2B, H3, H4), attorno al quale si avvolge il DNA, compattandosi in maniera ordinata. Il ruolo degli istoni nella conservazione del materiale genetico all’interno di uno spazio ristretto come quello del nucleo è talmente importante che queste proteine strutturali sono tra i gruppi più omogenei ed evolutivamente conservati presenti negli Eucarioti.

A dispetto dell’enorme fattore di compattazione (pari a quasi 10000 volte), il DNA deve essere però rapidamente accessibile al fine di permettere la sua interazione con i macchinari proteici che ne regolano le funzioni, quali la lettura delle informazioni in esso contenute. Gli istoni, e quindi i nucleosomi, non sono, dunque, entità completamente passive con funzioni esclusivamente strutturali ma strutture dinamiche soggette ad un gran numero di modifiche post-traduzionali. Modificazioni che sono in grado di regolare l'espressione genica in maniera epigenetica, ma sono anche implicate nella riparazione del DNA, nella segnalazione che induce la cellula a entrare in meiosi o in mitosi, o persino ad andare incontro ad apoptosi.

Esiste un ampio numero di modificazioni post-traduzionali a carico degli istoni: fosforilazione, acetilazione, metilazione, ADP-ribosilazione e ubiquitinazione. Tutte queste sono utilizzate come segnali per definire quali regioni del genoma debbano essere espresse in ogni specifico momento: alterano il grado di interazione degli istoni con il DNA e rendono il materiale genetico più o meno accessibile a un’ampia gamma di proteine cellulari deputate a legare una specifica modificazione istonica, a leggere il segnale in essa contenuto e a innescare o meno la trascrizione di un gene. Si tratta quindi di un vero e proprio codice istonico che ha una grande influenza sull'espressione genica.

La maggior parte di queste modificazioni avviene sulle “code” amino-terminali degli istoni (-NH3+) e sono a carico di specifici residui amminoacidici. Studi di sequenziamento condotti sull’istone H3 hanno dimostrato che le lisine presenti in all'estremità N-terminale sono spesso siti preferenziali di metilazione, anche se esistono differenze specie-specifiche. Oggi è noto che la lisina 9 dell’istone H3, quando metilata, porta alla formazione di un sito di legame per la heterochromatin protein-1 (HP1), una proteina in grado di indurre l’impacchettamento del DNA e quindi il silenziamento della trascrizione.

LO STUDIO

Le modifiche chimiche a carico del DNA che non coinvolgono cambiamenti nella sequenza dei nucleotidi regolano l’accesso dei fattori di trascrizione ai loro siti di legame e di conseguenza lo stato di attivazione funzionale dei geni. Sono i cosiddetti segnali epigenetici, modulati nella natura e nell’intensità dall’ambiente e fondamentali nel mediare la capacità dello stesso di regolare il genoma.

I segnali epigenetici generati dalle modificazioni post-trasduzionali a carico degli istoni suscitano grande interesse poiché sembrano coinvolti nelle alterazioni dei percorsi regolatori alla base dell’insorgenza del cancro e del diabete di tipo 2. Tuttavia sono processi difficili da studiare che pongono i ricercatori di fronte a grosse difficoltà da superare, soprattutto di ordine tecnico. Infatti, la mono-metilazione della lisina è purtroppo difficile da identificare e da misurare. Il basso peso molecolare del residuo metilico e la mancanza di una differenza di carica significativa tra la lisina mono-metilata e non metilata escludono de facto la rilevazione mediante metodi fisico-chimici diretti. Inoltre, lo sviluppo di anticorpi specifici in grado di riconoscere selettivamente una lisina metilata con poca o nessuna interferenza da parte della sequenza amminoacidica locale si è dimostrato molto problematico. Tutti questi limiti tecnici hanno ostacolato fino ad oggi l’analisi dell’istone metilato e le sue eventuali implicazioni mediche.

Prendendo ispirazione dalla natura, i chimici hanno cominciato ad esplorare la possibilità di utilizzare recettori sintetici per il riconoscimento della metilazione dell'istone. Finora, la maggior parte dell'attenzione è stata data ai residui di lisina dimetilati e trimetilati, mentre non esistono studi pregressi su recettori sintetici in grado di legare selettivamente lisine mono-metilate.

Lo studio condotto dai ricercatori INSTM delle Unità di Ricerca di Brescia, Parma e Milano, finanziato nell’ambito del programma INSTM-Regione Lombardia (progetto SUPRANANO) e pubblicato su ACS Applied Materials and Interfaces e Nanoscale, ha visto la realizzazione del primo esempio di sistema abiotico in grado di rivelare le lisine mono-metilate presenti nella coda peptidica dell’istone H3. Composto da un recettore sintetico accoppiato ad un micro-risonatore non-plasmonico, il sistema è in grado di riconosce e rivelare le lisine mono-metilate lungo la catena del polipeptide indipendentemente dalla loro posizione e numero.

I DETTAGLI DELLA RICERCA

I cavitandi tetrafosfonati (Tiiii) sono i soli recettori sintetici noti per essere in grado di legare con elevata selettività gli amminoacidi mono-metilati sia in acqua sia in solventi organici. In questo lavoro i ricercatori INSTM hanno valutato la capacità dei Tiiii di riconoscere e legare specificatamente i peptidi mono-metilati degli istoni H3, dimostrando effettivamente che i cavitandi tetrafosfonati catturano i peptidi in una soluzione a base di etanolo e interagiscono con elevata affinità con le lisine N-metilate (Lys-NMe+) presenti sulla coda degli istoni H3. Il riconoscimento è specifico a prescindere dalla posizione della lisina metilata lungo la catena amminoacidica e dal numero di lisine metilate contenute nel peptide. Questa “pan-specificità” promette migliori prestazioni del cavitando rispetto ai ligandi naturali (anticorpi).

Successivamente il complesso Tiiii-Lys-NMe+ doveva essere separato dalla soluzione e rilevato. L’utilizzo della Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) in sinergia con core-shell Raman-attivi, quali i T-rex, si è dimostrato essere l’approccio vincente per consentire la separazione, la trasduzione e l’amplificazione del segnale dei complessi peptide-Tiiii, senza degradare il complesso. I T-rex sono microsfere di ossido di silicio rivestite di un sottile strato di ossido di titanio sulle quali i complessi peptide-Tiiii si assemblano selettivamente. Il riconoscimento è trasdotto istantaneamente mediante i T-rex che amplificano “a freddo” l’impronta spettroscopica Raman del complesso cavitando-peptide .

LE IMPLICAZIONI

Al momento le applicazioni all’orizzonte si possono soltanto intuire, ma le enormi potenzialità sono evidenti: il sistema messo a punto dai ricercatori INSTM potrà essere la base per lo sviluppo di piattaforme sensoristiche destinate ad analisi di fingerprint proteico fino ad ora inaccessibili. Potranno aprire la strada alla diagnosi precoce di patologie segnalate da tale fingerprint proteico (ad esempio cancro alla prostata e Alzheimer) e più in generale allo screening di liquidi biologici per composti caratterizzati da residui cationici metilati, fra cui neurotrasmettitori, farmaci (fra cui antidolorifici e antidepressivi) e stupefacenti.

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